9 Kasım 1974'te Roma'da doğdu. Aktör Vittorio Mezzogiorno (1941-1994) ve aktris Cecilia Sacchi'nin (1938–2010) kızıdır. İki yıl Paris'te Peter Brook'un Le Centre International de Créations Théatrales atölyesinde çalıştı. 1995-96 sezonunda Bouffes du Nord'da Peter Brook'un yönettiği Qui est la adlı oyunda Ophelia rolüyle ilk kez sahneye çıktı. Shakespeare'in "Hamlet"inden alınan oyun, çeşitli Avrupa kentlerinde sahnelendi. Giovanni Mezzogiorno bu oyundaki rolüyle Coppola- Prati 1996 Ödülü'nü aldı.

1997'de Sergio Rubini'nin "Il viaggio della sposa" filmiyle beyazperdeye geçti. "İtalyan Sinemasının Yeni Yetenekleri", "Yabancı Basın Altın Küre" ve '97-98 yılı En İyi Kadın Oyuncu dalında Flaiano' gibi çeşitli ödüller aldı. 1998'de Michele Placido'nun yönettiği "Del perduto amore" adlı filmindeki rolüyle En İyi Kadın Oyuncu olarak "Nastro d’Argento", "Ciak d'Oro" ve "Il Premio Pasinetti" ödüllerine değer görüldü. 2001 yapımı Gabriele Muccino filmi Son Öpücük'le bir kez daha Flaiano Ödülü'nün sahibi oldu. 2003'te Ferzan Özpetek'in Karşı Pencere'sindeki Giovanna rolüyle büyük takdir kazandı ve İtalya'daki önemli ödülleri adeta süpürdü. Kolera Günlerinde Aşk, Vincere, I nostri ragazzi gibi filmlerle İtalyan Sineması'nın en gözde aktrisleri arasında yer almayı sürdürdü. 2010 yılında Cannes Film Festivali'nin jüri üyeleri arasında yer aldı.

2011 doğumlu Leone ve Zeno adlarında ikiz çocukları bulunmaktadır.