Sanatçı bir ailenin çocuğu olmanın avantajını daha küçük yaşlarda hissetmiştir. Annesi Virginia Admiral, bir ressamdı, babası Robert da şair, ressam ve heykeltıraş. Doğup büydüğü semtte ağırlıklı olan İtalyan komşuları bu içe kapanık çocuğu 'Bobby Milk' diye çağırırlardı. Utangaç bir çocuk olduğu doğruydu; zamanının çoğunu kitaplar arasında geçiriyordu. Broadway’de sahnelenen oyunlarla büyüyen De Niro, ilk kulis havasını Oz Büyücüsü rolüyle kokladı. On altı yaşına girince Çehov'un Ayı oyununda rol aldı. Tüm başarılı oyuncular gibi (örneğin Marlon Brando) ünlü tiyatro öğretmeni Stella Adler’den ders aldı. Kamerayla ise 1968 yılında çekilen Greetings filmiyle tanıştı. Buna rağmen ilk filmi 1963’te tamamlanan, ancak 1969’da gösterime giren The Wedding Party, ilk yönetmeni ise ve Brian De Palma sayılabilir. Ardından Hi, Mom!, Bloody Mama, Jennifer on My Mind, Born to Win ve The Gang That Couldn’t Shoot Straight gibi küçük bütçeli filmler geldi. 1973'te De Niro ve yönetmen Martin Scorsese birlikte filmler çevirmek üzere adım attılar. İlk filmleri Mean Streets, sonraki yıllarda gelecek sekiz filmin habercisi oldu. 1976’da Taxi Driver ve 1977’de New York, New Yorkta birlikte çalışan De Niro ve Scorsese, artık ikili olarak anılır olurlar. Ardından Kızgın Boğa / Raging Bull (1980), The King of Comedy (1983), Sıkı Dostlar / Goodfellas (1990), Korku Burnu (1991) ve Casino (1995) gelir. Bir yıldız olmasını sağlayan, şüphesiz muhteşem oyunculuğuyla The Godfather II filmi olmuştur.